В процессе проведения генетических исследований мы часто сталкиваемся с недостаточностью образцов РНК, например, для изучения крошечных анатомических опухолей полости рта, даже одноклеточных образцов, и образцов специфических генных мутаций, которые на очень низком уровне транскрибируются в клетках человека.Конечно, для теста на COVID-19, если мазки не в нужном месте или недостаточное количество раз во время отбора проб, размер выборки будет очень низким, поэтому Комиссия по здравоохранению и планированию семьи вышла два дня назад и прошел тест, и если пробоотборник нуклеиновых кислот не взял шесть образцов, вы можете сообщить об этом.
Чувствительность реагента важна, потому что у нас есть та или иная проблема, так что же мы можем сделать, чтобы улучшить чувствительность ОТ-ПЦР?
Прежде чем мы обсудим возможные решения, давайте упомянем о двух больших осложнениях ситуации, которую мы только что упомянули.
Прежде всего, нас беспокоит потеря РНК, когда в нашем образце всего несколько клеточных популяций.Если используются традиционные методы разделения и очистки, такие как колоночный метод или метод осаждения нуклеиновых кислот, существует высокая вероятность того, что несколько образцов будут потеряны.Одним из решений является добавление молекулы-носителя, такой как тРНК, но даже в этом случае нет гарантии, что наш эксперимент по восстановлению пройдет успешно.
Итак, как лучше?Хорошим вариантом для культивируемых клеток или микроанатомических образцов является использование прямого лизиса.
Идея состоит в том, чтобы разделить клетки на 5 минут, выпустить РНК в раствор, затем остановить реакцию на 2 минуты, затем добавить лизат непосредственно в реакцию обратной транскрипции, чтобы не потерять РНК, и, наконец, поместить полученную кДНК прямо в реакцию в реальном времени.
Но что, если из-за ограниченной отправной точки или небольшого количества экспрессии целевого гена мы можем переработать всю РНК и все равно не предоставить достаточное количество матриц для получения хорошего сигнала в реальном времени?
В этом случае этап предварительного усиления может быть очень полезен.
Ниже представлена схема повышения чувствительности после обратной транскрипции.Прежде чем начать, нам нужно спросить нижестоящих, какие мишени нас интересуют, чтобы разработать конкретные праймеры для этих мишеней для предварительной амплификации.
Этого можно достичь, создав смешанный праймер, содержащий до 100 пар праймеров, и реакционный цикл от 10 до 14 раз.Следовательно, для предварительной амплификации полученной кДНК необходима мастер-микс, специально разработанный для этого требования.
Причина установки количества циклов между 10 и 14 заключается в том, что это ограниченное количество циклов обеспечивает случайность между различными мишенями, что имеет решающее значение для исследователей, которым нужна количественная молекулярная информация.
После предварительной амплификации мы можем получить большое количество кДНК, так что чувствительность обнаружения на бэк-энде значительно повысится, и мы даже можем разбавить образец и провести несколько реакций ПЦР в реальном времени, чтобы исключить возможные случайные ошибки.
Время публикации: 11 апреля 2023 г.